脂質過氧化物（LPO）含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC5240

規(guī)格：50T/48S

產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前取1瓶試劑二加入14mL 蒸餾水，此試劑較難溶，可以 70℃加熱并劇烈振蕩以促進溶解，或者通過超聲處理以促進溶解。每次用前需檢查是否有粉劑析出。用不完的試劑可在2-8℃中保存一個月。

2. 標準品：為1000nmol/mL的標準溶液。

產品說明：

脂質過氧化物（lipid hydroperoxide LPO）是不飽和脂肪酸鏈經自由基或活性氧作用后產生的過氧化物。病理情況下，脂質過氧化反應增強可導致原本低含量的LPO升高。LPO含量升高會對細胞的結構和功能造成損傷，LPO含量與機體免疫系統(tǒng)和衰老密切相關。

LPO在酸性條件下加熱產生丙二醛（MDA），MDA與硫代巴*妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成棕紅色物質三甲川（3,5,5-三甲基惡唑-2,4-二*），其最大吸收波長在 532nm，進行比色后可估測樣本中LPO的含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液器、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、1mL玻璃比色皿、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、組織：按照樣本質量（g）：提取液體積（mL）為1:5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿；8000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2、細菌或細胞樣本：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清，按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為 500~1000:1 的比例（建議500萬細菌或細胞加入 1mL 提取液）加入提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲 3s，間隔 7s，總時間3min），8000g 4℃離心10min，取上清置冰上待測。

3、培養(yǎng)液或其他液體：直接檢測。若溶液渾濁則離心后取上清進行測定。

二、測定步驟

1、可見分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至532和600nm，用蒸餾水調零。

2、標準溶液的制備：現標準液為1000nmol/mL的MDA標準溶液，將標準液用稀釋液稀釋至20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 nmol/mL備用，具體稀釋可參考下表。

備注：實驗中每個標準管需400µL標準溶液。

3、在EP管中按下表步驟加樣：

     將混合液在 45℃（植物樣本）或100℃（其他樣本）水浴60min 后（標準管在兩個溫度水浴均可），置于冰浴中冷卻，8000g，常溫，離心 10min。吸取 900μL 上清液于1mL玻璃比色皿中，測定各樣本在 532nm和600nm處的吸光度。分別計算 ΔA=（A532_測定-A532_對照）-（A600_測定-A600_對照），ΔA標準=（A532_標準-A532_空白）- (A600_標準-A600_空白）（標準曲線，空白管和對照管只需做 1-2 次）。

二、LPO含量的計算

1. 根據標準管的濃度（x，nmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA（y，ΔA）代入公式計算樣本濃度（x，nmol/mL）

2. 按樣本蛋白質濃度計算

LPO含量（nmol/mg prot）=x×V樣÷（Cpr×V樣）= x÷Cpr

3. 按樣本質量計算

LPO含量（nmol/g 質量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）= x÷W

4. 按細菌/細胞數量計算

LPO含量（nmol/10⁴cell）= x×V樣÷（V樣÷V樣總×細胞數量（萬個））= x÷細胞數量（萬個）

5. 按照液體樣本體積計算

LPO含量（nmol/mL）= x

V樣：加入樣本體積，0.4mL，V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。

注意事項：

1. 待測液如果有密集小氣泡，建議靜置20min左右等待氣泡消失再測，以免影響測定結果，如果有少量氣泡可以通過低速離心或輕磕等方式來消除。

2. 待測液如果尚未澄清，可吸取上清液后再次離心。

3. 為防止水浴60min過程中水分散失，建議使用螺旋管或用封口膜給EP管纏口。

4. 如果用高溫助溶試劑二，需要待其冷卻至室溫后再使用。

5. 如果測定吸光值過低或接近空白，適當延長反應時間或加大樣本量后，重新測定。如果吸光值過大或超過檢測范圍（A532＞1.5或者ΔA＞1.5時），建議將樣本適當稀釋后進行測定。注意同步修改計算公式。

實驗實例：

1. 稱取0.1192 g綠蘿葉片，按照測定步驟操作，測得計算A532_測定= 0.143，A532_對照= 0.005，A600_測定= 0.023，A600_對照 = 0.004，?A=0.119，將?A代入標曲公式y =0.0289x + 0.0032，R²=0.9993，計算得x=4.007，按樣本質量計算得：
LPO含量（nmol/g 質量）= x÷W = 33.616 nmol/g 質量。

2. 稱取0.1209g大鼠心臟，按照測定步驟操作，測得計算A532_測定= 0.122，A532_對照= 0.008，A600_測定=0.051，A600_對照= 0.003，?A=0.066，將?A代入標曲公式y =0.0838x + 0.0045，R²=0.9989，得出x=0.734，按樣本質量計算得：
LPO含量（nmol/g 質量）= x÷W = 6.071 nmol/g 質量。

參考文獻：

Hiroshi Ohkawa, Nobuko Ohishi, Kunio Yagi,Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction[J],Analytical Biochemistry,1979.

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